免疫組化常見問題分析

1.脫片產(chǎn)生的原因有哪些

  1、烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

  2、多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。

  3、組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

  4、修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

  5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

  6.組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

2.邊緣效應(yīng)

1、組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2、切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

3.切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性sing與非特異性著色

全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。

（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。

（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。

（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

4.免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤；

2、抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)；

3、組織切片本身這種抗原含量低；

4、血清封閉時間過長；

5、DAB孵育時間過短；

6、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

5.背景

1、考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>

2、然后調(diào)整DAB孵育時間；

3、也要考慮血清封閉時間是否過短；

4、適當增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。