用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體
摘要：
983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp）之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們的興趣。人們推測其可能成為這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進一步探索其致病機理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yǎng)，切片染色，細菌直接涂片染色，快速尿素酶測定及3C尿素呼吸試驗和4C尿素呼吸試驗等

相關(guān)專題ELISA免疫實驗技術(shù)
983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌(Hp)之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們的興趣。人們推測其可能成為這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進一步探索其致病機理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yǎng)，切片染色，細菌直接涂片染色，快速尿素酶測定及3C尿素呼吸試驗和4C尿素呼吸試驗等。除尿素呼吸試驗外其余方法均需通過胃鏡檢查才能完成，鑒于取材困難，進一步尋找檢測Hp感染的免疫學(xué)方不進非常必要的。國外有人用酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)檢測臨床病人血清中有Hp抗體報道，國內(nèi)尚未有這方面研究報告。本文報道建立一種檢測人體抗Hp抗體的ELISA的實驗結(jié)果及與細菌培養(yǎng)法和尿素酶測定法對比檢測結(jié)果，研究證明本法特異、敏感、適用于大量標本普查和及時判斷治療反應(yīng)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
材料和方法
. 材料
①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chǎn)品。②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實驗室自行設(shè)計制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀：南京華東電子管廠產(chǎn)品。④試劑：過氧化物酶(HRP)，R2=3.2，美國sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺(OPD)：上海白鶴化工廠產(chǎn)品，按文獻配制。包被液：取碳酸鈉.59g加2.93g，蒸餾水000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液00ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液：5%小牛血清。戊二醛固定液：25%戊二醛液，00ml裝，Kochligh進口分裝，用時稀釋成0.25%戊二醛固定液。終止液：2NH2SO4。⑤抗原的制備：將澳大利亞*佩思醫(yī)院的Hp標準菌株(NCTC638)及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學(xué)鑒定(自制兔抗Hp抗體)，然后取單個菌落移種于另一血平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定(0.%～0.3%)，4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將zui后次沉淀懸于少量PBS液內(nèi)，用比濁管沒出細菌濃度，制成含菌3×09ml，置冰箱冰凍，反復(fù)凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存?zhèn)溆?。⑥臨床血清標本：采自胃鏡檢查患者，隨機采取988年8～0月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存-20℃?zhèn)溆?。⑦陰性對照血清，進行ELISA測定，取其平均OD值作對照。⑧酶標羊抗人IgG結(jié)合物(SAHIgG—HRP)的制備：按過碘酸鹽改良法，略加改進標記制成酶標抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續(xù)攪拌5min，對pH4.2，0.00mol/L醋酸鹽緩沖液(用2molHC調(diào)pH)透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG(上海生物制品研究所產(chǎn)品)4mg，逐滴加pH，.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉(4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.0molPB-0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內(nèi)結(jié)合物，以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測定精制結(jié)合物，E/P克分子比值合格后，將結(jié)合物小瓶分裝置-20℃保存，備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻進行。
.2 方法
并稍加改進，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×08億/ml(含蛋白8.6μg)稀釋后，每孔加00μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內(nèi)液體，然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次(每次3min)，加5%小牛血清液，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體。每孔加待檢血清(：00稀釋)00ml，37℃保溫h后，如上洗滌3次，同時做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結(jié)合物00ml，37℃保溫半小時，于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應(yīng)后，于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值(P)與陰性對照OD值(N)比(P/N)，若P/N比大于或等于2.0為陽性。用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體