谷研試劑-細胞受體結(jié)合免疫測定CIC法

  細胞受體結(jié)合免疫測定法是根據(jù)CIC可與某些細胞表面的Fc受體或補體受體結(jié)合而建立的細胞技術(shù)，這類方法有靈敏度較高，特異性較強等優(yōu)點，但需進行活細胞培養(yǎng)或細胞分離，影響因素多，重復性較差，目前僅適用于實驗研究。此類技術(shù)有多種方法。

    Raji細胞是從Burkitt淋巴瘤患者分離建株的B淋巴細胞系?？稍隗w外連續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞表面沒有膜免疫球蛋白，Pc受體的親和力很低，但有C3、C3b和C3d受體及Clq受體，而且不易脫落。因此能使結(jié)合補體的IC吸附在細胞上，然后再于反應系統(tǒng)中加入熒光素或i25標記的抗人IgG抗體，使其與結(jié)合在Raji細胞上的IC中的IRC反應，計算Rail細胞上結(jié)合的IC中滲入的核素量，即可判定IC的存在與含量。

(一)試劑

    ．Raji細胞懸液  將Raji細胞培養(yǎng)在含20％小牛血清的RPMI-640培養(yǎng)液中2—3d后即可收集應用，該細胞培養(yǎng)時不貼壁、不結(jié)團，生長容易(一般3d即可傳一代)，培養(yǎng)條件不苛求。但pH值應在6．5左右，超過pH7．0則生長不良。收集細胞時要計數(shù)和檢查活細胞，臺盼藍排除試驗要求活細胞在95％以上。

    2．核素標記抗IgC抗體  將兔抗人IgC血清經(jīng)DE52分離兔IsC，用PBS稀釋成蛋白質(zhì)mg／mL，按每ug蛋白質(zhì)結(jié)合0．3uCi25I標記抗人IgC抗體。

(二)操作步驟

    ．取培養(yǎng)72h的Raji細胞 800r／rain離心0rain，棄去上清液，細胞沉淀中加入不含小牛血清的640培養(yǎng)液，洗2次。

    2．計數(shù)Raji細胞數(shù)，用*640培養(yǎng)液配成07／mL細胞懸液。

    3．取滴細胞懸液加等量0．％臺盼藍，放37℃0rain，鏡檢著色細胞不應超過5％。

    4．在試管中加入細胞懸液50~L，再加入：4稀釋的受檢血清25uL。

    5．搖勻后放37~(2 45rain，每5-0rain輕搖一次，使其充分作用。

    6．用640培養(yǎng)液將細胞洗滌3次， 000r／min離心5min，棄去上清液。

    7．在細胞沉淀物中加25I標記的抗人TgG抗體，用含％人血清白蛋白(HSA)的640培養(yǎng)液將標記物稀釋成7-0ug／mL。加入標記物后置4℃30min，每間隔5—0min輕搖次。

    8．用含％人血清白蛋白(HSA)的640培養(yǎng)液洗滌3次，每次 800r／rain離心0min。

    9．取細胞沉積物用Y計數(shù)器測cpm值。

  0．用熱變性IgG40ug溶于50uL新鮮混合人血清中，然后倍比稀釋成0個稀釋度，按上述方法操作測定cpm。

(三)結(jié)果判斷

    以熱聚合IgC的含量為橫坐標，cpm為縱坐標繪制標準參考曲線。自參考曲線查出IC中IgC的ug數(shù)，按ug/mL報告。

(四)注意事項

    ．Raji細胞有時也帶有Pc受體和表面膜免疫球蛋白，為使實驗結(jié)果反映真實情況，應預試條件，同時在實驗中加陰性對照。

    2．用熱變性IsC作對照和參考時，一定要用新鮮血清作稀釋劑，以補充補體。

除此以外，細胞受體結(jié)合免疫測定方法中的血小板凝集試驗亦用于實驗研究。其原理是免疫復合物與血小板相互作用后引起血小板表面發(fā)生改變，導致血小板凝集(有人認為血小板凝集與其表面Fc受體活化有關(guān))。試驗中必須采用新鮮分離的有活力的血小板，因為在IC存在時，血小板表面的改變有賴于其代謝狀態(tài)。除IC外，高濃度的游離免疫球蛋白與血小板表面抗原反應的抗體和其他物質(zhì)，如荷電分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集；Clq、IgM、RF能抑制IC引起的血小板聚集；待檢血清于試驗前加熱滅活，會使其血小板凝集滴度升高或降低。