細(xì)胞培養(yǎng)基純化實驗和包被液的操作過程

　純化實驗操作步驟：

    ．去除培養(yǎng)液；

　　2．×無鈣鎂PBS洗滌；

　　3．加入×EDTA(0×EDTA用PBS稀釋。)37℃孵育5分鐘。

　　4．加入ES培養(yǎng)基使失活；

　　5．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入5ml離心管中離心3min；

　　6．去除上清，將細(xì)胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打0－20次。

　　如果加入培養(yǎng)基的量較少會比較容易將細(xì)胞團弄散分開。ES細(xì)胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細(xì)胞的自然分化。

　　7．將細(xì)胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時（分化細(xì)胞在該時間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸浮）；

　　8．將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入明膠包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開。

　　9．建議按：4－：0的比率傳代(ATCC)

　　保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到zui低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表來計算傳代比率。

包被液的準(zhǔn)備：

　　多聚-L-，5μg/ml

　　把75ml多聚-L-和425ml ×PBS混合。貯存在4℃。

　　纖維結(jié)合蛋白，μg/ml

　　把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml ×PBS混合。

　　包被過程：

　　．加入多聚-L-，至少2－3小時（過夜也行）

　　2．吸出多聚-L-

　　3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約－2小時

　　4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干

　　5．貯存在4℃

　　24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)基孔。有時需要劇烈震蕩培養(yǎng)板。