之前已分別構(gòu)筑出GUS 基因的表現(xiàn)質(zhì)體pQG，要啟動(dòng)子T5promotor 的啟動(dòng)受到好的調(diào)控，應(yīng)進(jìn)一步將pQG 轉(zhuǎn)形至大腸桿菌M5[pREP4]。 M5[pREP4] 可持續(xù)表現(xiàn)lac repressor，pQG 上用以驅(qū)動(dòng)GUS基因表現(xiàn)的T5 promoter 的活性將因而受到抑制，細(xì)胞但一旦加入IPTG 就能誘導(dǎo)GUS基因大表現(xiàn)。 在這一節(jié)的實(shí)驗(yàn)里，我們將分別自經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)與未經(jīng)誘導(dǎo)的pQG/M5[pREP4] 菌體抽取total RNA，以以方雜合反應(yīng)分析GUS mRNA的表現(xiàn)情形。

    下面所采用的方法適用于大腸桿菌及其他革氏陰性菌total RNA的抽取，實(shí)驗(yàn)進(jìn)時(shí)先以lysozyme 分解細(xì)胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）解原生質(zhì)膜 （Summers, 970; Ausubel et al., 2005）；的后加入適的氯化鈉溶液將SDS、蛋白質(zhì)及大腸桿菌的染色體DNA 一并沉淀下，并以離心法移除，存于上清液的RNA 則以酒沉淀。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程所使用的RNase 抑制劑為DEPC。

    儀器用具：恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；冰??；微離心機(jī)；分光光計(jì) （Hitachi U-00 spectrophotometer）

    藥品試劑：大腸桿菌菌株pQG/M5[pREP4];LB 培養(yǎng)液;Ampicillin （00 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （ M）;Protoplasting buffer （5 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer 細(xì)胞（0 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0 mM NaCl; mM sodium citrate; .5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;飽和氯化鈉溶液 （以40 g氯化鈉溶解于00 mL dH2O/DEPC）;酒及70%酒