結(jié)果分析與鑒定

(一)細(xì)胞觀察

．在倒置相差顯微鏡下，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底時，典型的平滑肌細(xì)胞為梭形，平行呈束狀排列，密集與稀疏交叉呈“峰”與“谷”狀，峰處細(xì)胞密集、多層；谷處細(xì)胞稀疏甚至沒有細(xì)胞。

2．電鏡下觀察，可把平滑肌細(xì)胞分為“合成型”與“收縮型”兩型。前者胞質(zhì)充滿楹面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但粗肌絲或細(xì)肌絲很少，肌動蛋白的抗體熒光染色為陰性，細(xì)胞無收縮功能?！笆湛s型”細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞的典型表現(xiàn)，主要特征為胞質(zhì)內(nèi)有束狀肌絲，細(xì)胞有收縮功能。

3．原代培養(yǎng)的zui初周內(nèi)細(xì)胞以“收縮型”為主，以后逐漸向“合成型”轉(zhuǎn)化且大量繁殖。傳代培養(yǎng)zui初從“收縮型”向“合成型”轉(zhuǎn)化很快，6～0d后又復(fù)原，但已無收譬功能。

(二)MTT比色法

．MTT能進(jìn)入活的線粒體內(nèi)，與各種脫氫酶反應(yīng)，可用于測定細(xì)胞的成活及增殖。

2．以PBS溶解MTT制成5mg／ml溶液，抽濾滅菌。按每孔00μl培養(yǎng)液加入0μl的量把MTT加入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

3．取出培養(yǎng)板，吸出孔中培養(yǎng)液，每孔加入00μl酸性異丙醇(含0．04 ml／L HCl)，使深藍(lán)色結(jié)晶*溶解。

4．在室溫下放置數(shù)分鐘，確認(rèn)結(jié)晶*溶解后即把培養(yǎng)板在570 nm、630 nm處．控l設(shè)在．99(如樣品著色過強，則設(shè)在．00)的多7L掃描分光光度計下讀數(shù)。在加入異丙后l h內(nèi)測定完畢。

5．也可以使用DMSO每孔320μl代替異丙醇溶解細(xì)胞內(nèi)MTT，在酶聯(lián)免疫測定儀上司570nm或570 nm、630 nm雙波長處測定吸光值并分析。

(三)3 H-TdR放射免疫測定

．將待測細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，每孔加入含3 H—TdR的培養(yǎng)液200μl(含放射量3．7×0 4Bq)，37℃孵育24 h后終止培養(yǎng)。

2．以冷PBS200μl清洗3次，加入4℃的0％TCA 200 μl，放于4℃冰箱內(nèi)30 min。

3．吸去TCA，加入乙醚一乙醇(：2)混合液200μl漂洗，吸去液體，晾干。

4．加入O．4 mol／L NaOH溶液每孔200μl溶解細(xì)胞，在56℃恒溫箱中放置2h。

5．吸出全部液體，注入含有5ml閃爍液的閃爍瓶中，加蓋搖勻，放置2h后進(jìn)行液閃測定。