)訓(xùn)練目的

    了解雞胚的發(fā)育過程；掌握雞胚原代細(xì)胞制備及培養(yǎng)技術(shù)。

2)實驗材料

①試劑：Hank’s液、含0％～20％血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、碘酊棉、酒精棉、0．25％。

②器材：超凈工作臺或生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、洗耳球、滅菌吸管、平皿、毛細(xì)吸管、離心管、剪刀、小鑷子、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

3)操作步驟

()雞胚的孵育

受精雞胚放在蛋托上，大頭朝上，放人溫箱培養(yǎng)。在溫箱底部放上一盤水，溫度調(diào)至37．8℃。

(2)雞胚的發(fā)育過程

①觀察方法：將9～2 d的雞胚取出，放人平皿中進行觀察。

②雞胚的發(fā)育：采用雞胚進行細(xì)胞培養(yǎng)時，應(yīng)對雞胚的發(fā)育有一個初步了解。雞胚的發(fā)育是由受精卵開始的。它在通過輸卵管時，已開始分裂，當(dāng)產(chǎn)卵時已在卵黃上部形成一層細(xì)孢，稱為胚盤，在適宜的條件下胚盤繼續(xù)分裂生長。在發(fā)育過程中從卵黃和卵白中獲取養(yǎng)料和水分．由于胚體和卵黃分開的緣故，胚胎只通過卵黃帶與卵黃相連。發(fā)育的早期形成3個胚層，即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層，由此形成的胚胎的各個器官和組織。一般孵育至3 d出現(xiàn)尿囊，為直腸側(cè)部分的膨出物，尿囊膜是由內(nèi)胚層和中胚層構(gòu)成的。至第4～5 d胚體出現(xiàn)羊膜、尿囊膜及絨毛膜層包被。羊膜系由外胚層和中胚層組成，開始時緊貼于胚體上，后來腔內(nèi)逐漸充滿羊水。尿囊膜在生長發(fā)育的過程中，與絨毛膜相連而成絨毛尿囊膜，此膜由三層細(xì)胞組成：外層為外胚層，內(nèi)層為內(nèi)胚層，中間為中胚層，其中有很多血管，有兩條主動脈自卵黃囊延伸到此膜中，與此并行有兩條主靜脈，匯成一較大的尿囊靜脈。絨毛尿囊膜是雞胚的呼吸器官，位于殼膜之內(nèi)。此膜生長發(fā)育很快，第0 d已包圍了整個雞胚，此時雞胚已出現(xiàn)羽毛，呼吸道的發(fā)育在第2～5 d出現(xiàn)。胚胎體積逐漸增大時，胚胎腔外體液El趨減少，孵出小雞時已無胚胎腔外體液。在發(fā)育早期，尿囊液及羊水的成分與生理鹽水溶液相差無幾，2 d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔積累了腎臟的排泄物，因此，在2 d或3 d后，尿囊液由于尿酸鹽的存在，使原來透明的液體呈現(xiàn)混濁。尿囊液的酸堿度在7—2 d期間呈弱堿性，在孵育的末期為pH 6．O。6～3 d雞胚羊水的平均量為5—0mL，至3 d有時可達lO mL。卵白的水分在發(fā)育的zui初7 d中轉(zhuǎn)移到卵黃囊內(nèi)，在第6 d卵白轉(zhuǎn)入羊水腔為胚胎所吞食。卵黃在發(fā)育時逐漸被一層細(xì)胞包圍，自2 d以后卵黃逐漸干燥，在孵出之后24～48 h，整個卵黃囊被吸入小雞腹腔內(nèi)，供雛雞出生后zui初幾天的營養(yǎng)。

(3)雞胚原代的細(xì)胞培養(yǎng)

①消毒：選9～2 d的雞胚2—3個放入超凈工作臺中，大頭(氣室)朝上放置，先用碘酊棉，消毒氣室部位。

②取雞胚：用鑷子剝?nèi)ヮ^、四肢及內(nèi)臟，洗2—3次，用Hank's液洗去紅細(xì)胞，吸去液體。

③剪碎雞胚及清洗：用小剪刀將雞胚反復(fù)剪碎成泥狀，加Hank's液，吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，稍靜置，讓組織下沉，吸去液體。用Hank's液洗2～3次，吸去液體，以去除紅細(xì)胞等。

④加：根據(jù)組織的多少加入一定量的O．25％，的量以將組織塊浸泡在中為適中，一個雞胚一般加0．25％的4～5 mL。

⑤消化：用膠塞封緊，輕搖均勻，置4℃冰箱靜置過夜或37 ℃水浴消化 h。

⑥洗去：消化完畢后，吸出，用Hank's液或PBS洗3次以洗去，吸去洗液后。洗時注意輕搖，如猛烈搖動，會將組織塊搖散，吸去洗液后，用營養(yǎng)液將細(xì)胞洗出，放入培養(yǎng)瓶。

⑦計數(shù)培養(yǎng)：加入適量的*培養(yǎng)液(0～20 mL)，用吸管反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計數(shù)法，計算每mL營養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)，根據(jù)所計算的細(xì)胞數(shù)，將原液稀釋成06個／mL。將稀釋好的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，一般200 mL培養(yǎng)瓶，放5—20 mL培養(yǎng)液，節(jié)約時可放lO mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量以覆蓋瓶底為適中。

⑧放入37℃、5％CO2溫箱培養(yǎng)：培養(yǎng)時，培養(yǎng)瓶的蓋不要擰得太緊，以不會下掉為度，以便CO2進入。培養(yǎng)～2 d后長成單層細(xì)胞，即可應(yīng)用。

4)注意事項

①全部操作過程應(yīng)在無菌條件下完成。

②故人5％CO2溫箱培養(yǎng)的目的是5％CO2能調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中的pH，使之在一個星期或更長時間pH保持不變。