免疫共沉淀（Co-IP）試劑準(zhǔn)備

 1.  預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)。

 2.  用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS。

3.  加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5x106個(gè)細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。

 4.  用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。

 5.  4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。

 6.  準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

 7.   每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

 8.   4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子。

 9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）。

 10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 ug/ul）。

 11.  加入一定體積的兔抗到500 ul總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。

 12.  4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。

 13.  加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 ul "過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。

 14.  14000 rpm瞬時(shí)離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有時(shí)候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。

 15.  用60 ul 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）。

16.  將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。