跨膜蛋白SEMA5A抗體抗體的生物素化標記實驗要點:

1. 如在反應(yīng)混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在,會抑制標記反應(yīng)。因此,蛋白質(zhì)在反應(yīng)前要對 0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖液或0.5mol/L硼酸緩沖液充分透析;

2.所用的NHSB及待生物素化蛋白質(zhì)之間的分子比按蛋白質(zhì)表面的ε-氨基的密度會有所不同,選擇不當則影響標記的效率,應(yīng)先用幾個不同的分子比來篩選最適條件;

3.用NHSB量過量也是不利的,抗原的結(jié)合位點可能因此被封閉,導致抗體失活;

4.由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此時可加入去污劑如 Triton x-100, Tween20等;

5.當游離ε-氨基(賴氨酸殘基的氨基)存在于抗體的抗原結(jié)合位點時,或位于酶的催化位點時,生物素化會降低或損傷抗體蛋白的結(jié)合力或活性;

6.生物素還可能與不同的功能基團,如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基,也可與糖基共價結(jié)合;

7.交聯(lián)反應(yīng)后,應(yīng)充分透析,否則,殘余的生物素會對生物素化抗體與親和素的結(jié)合產(chǎn)生競爭作用;

8.在細胞的熒光標記實驗中,中和親和素的本底低,但由于鏈霉親和素含有少量正電荷,故對某些細胞可導致高本底。