ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。      在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。 原理如下： ①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。         操作步驟 　　方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 　　1.　包被：用0.05M PH9.?碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。 　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O?D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O?D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。 　　方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法： 　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔 　　　　　　中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml， 　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 　　(三)　試劑器材 　　1.　試劑 　　(1)　包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液): 　　　　　　NaCO３1.59克 　　　　　　NaHCO３　 2.93克 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(2)　洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克 　　　　　　Na2HPO４?12H2O　　2.9克 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　(3)　稀釋液： 　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml 　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。 　　(4)　終止液(2M　H２SO４）： 　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。 　　(5)　底物緩沖液(PH5.0磷酸 檸檬酸): 　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml 　　　　0.1M 檸檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml 　　　　加蒸餾水50ml。 　　(6)　TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液: 　　　　TMB(10mg／5ml無(wú)水乙醇) 0.5ml 　　　　底物緩沖液(PH5.5)　　　 10ml 　　　　0.75％H２O２　　 　32μl 　　(7)　ABTS使用液: 　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg 　　　　底物緩沖液(PH5.5)　 1ml 　　　　3％H２O２　 　2μl 　　(8)　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。 　　(9)　正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。 　　2.　器材: 　　(1)　聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。 　　(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。 　　(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。