檢查過程

() 蛋白質(zhì)樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-min。然后4℃，3,000g離心5min。取上清液作為樣品。

(2) 電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。　

(3) 轉移：(半干式轉移)

① 電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。

② 膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖液中0min。

③ 轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流mA/cm2，轉移.5hr。轉移結束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。

(4) 免疫反應：　

① 用0.0M PBS洗膜，5min ×3次。

② 加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr?！?strong>細胞

③ 棄包被液，用0.0M PBS洗膜，5min×3次?！?br>

④ 加入一抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃ 放置2hr以上。陰性對照，以%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。　

⑤ 棄一抗和%BSA，用0.0M PBS分別洗膜，5min×4次。　

⑥ 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動，室溫2hr?！?br>

⑦ 棄二抗，用0.0M PBS洗膜，5min×4次?！?br>

8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。細胞