免疫組化實(shí)驗(yàn)中的抗原修復(fù)

、酶消化：如、、蛋白水解酶

2、抗原熱修復(fù)：高壓法、微波法、水煮法

*，免疫組化染色中zui關(guān)鍵的莫過于抗原修復(fù)，而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，熱抗原修復(fù)優(yōu)于酶消化，更有效，染色結(jié)果更易一致，操作單一。

3、修復(fù)時(shí)間：既要獲得zui強(qiáng)的染色結(jié)果，又要保持組織形態(tài)的完整性。許多抗原修復(fù)存在的問題是組織固定時(shí)間過短時(shí)，強(qiáng)烈的抗原修復(fù)可引起形態(tài)破壞、脫片及組織*消化，解決的方法可采用較短時(shí)間的熱修復(fù)或減少酶的消化時(shí)間。

4、抗原修復(fù)緩沖液：有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、 Tris （pH7-8）、EDTA（pH8.0~9.0） 、 EGTA（pH9.0） 等，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體，Tris和 EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。目前還沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適用于EDTA和EGTA緩沖修復(fù)液，一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇高pH值的修復(fù)液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D等。

5、抗原熱修復(fù)注意事項(xiàng)：無論哪一步都不要讓切片干凅，加熱后需要冷卻5-30分鐘。充分的抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的*重要因素，加熱的溫度和時(shí)間可導(dǎo)致修復(fù)不足或過度修復(fù)。

6、抗原熱修復(fù)對(duì)組織中內(nèi)源性的影響：抗原熱修復(fù)在增強(qiáng)抗原決定簇表達(dá)的同時(shí)，也增強(qiáng)了組織中內(nèi)源性的反應(yīng)。采用卵白素-（Avidin-biotin）檢測(cè)系統(tǒng)，組織中內(nèi)源性容易出現(xiàn)人為假象，在加熱抗原處理?xiàng)l件*相同的陰性對(duì)照片中可以觀察到較強(qiáng)的內(nèi)源性的反應(yīng)，沒有經(jīng)過熱抗原處理的切片中沒有出現(xiàn)類似的情況。在細(xì)胞漿中呈均一的細(xì)顆粒狀的淺棕色陽性，有時(shí)表達(dá)也非常強(qiáng)，與真陽性的結(jié)果表達(dá)很相似，在以往的免疫組化染色中內(nèi)源性的影響對(duì)診斷造成許多的誤差，卻常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，陰性對(duì)照片必須與一抗的抗原修復(fù)處理?xiàng)l件*相同，才能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性出現(xiàn)的部位。

7、內(nèi)源性封閉方法：一般在抗原修復(fù)以后，加抗體前使用卵白素進(jìn)行阻斷處理，也可使用非的檢測(cè)系統(tǒng)，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。